摘要：细胞分泌活动涉及一系列复杂的分子活动和信号转导过程, 它是许多重要生命活动如神经递质的释放、 内分泌激素分泌、蛋白质转运等的基础。故而有关细胞分泌活动的研究近年在国际上形成一个新的热点。有关免疫细胞中细胞因子的分泌机制研究的较少, 将膜电容测量、 电化学测量、光学测量、 胞内信号分子光解等近年发展起来的生物物理方法引入免疫学领域, 对研究免疫细胞的分泌调控和信号转导意义重大。细胞分泌活动是生物体信息传递和细胞功能的基本过程之一, 如神经系统中神经递质和激素的分泌、免疫系统中细胞因子和抗体的分泌等。细胞分泌活动涉及一系列复杂的分子活动和信号转导过程, 随着新技术尤其是细胞分泌检测技术的不断出现,这一过程正在被逐步揭示出来。目前对神经递质释放的研究已经很深入,而对免疫细胞分泌活动尤其是细胞因子分泌的动力学和分泌调控机制的研究则相对较少。将膜电容测量、电化学测量、 光学测量、细胞内信号分子光解等生物物理方法引入免疫学领域, 可能为免疫细胞分泌的调控和信号转导研究提供大量有意义的数据, 从而尽快填补该领域的研究空白。

　　1 单细胞分泌实时测量的新方法

　　细胞分泌活动的传统研究方法主要采用ELISA、 RIA、 FACS等阶段性定量测定或冰冻蚀刻电镜技术、 普通光学显微镜技术等形态学研究方法,都属于非现场静态研究, 并且是大量细胞共同3期娄雪林等: 免疫细胞分泌研究进展生理学报Acta Physiol. Sin.54卷测定。近年来,各种实时监测技术的发展极大地促进了人们对细胞分泌机制的了解。下面就目前常用的三种细胞分泌实时检测技术的原理、方法以及优缺点作简要介绍。

　　1.1 膜电容测量

　　近10年来, 膜电容检测技术在研究细胞胞吐和胞饮机制方面得到了越来越广泛的应用［1］。细胞分泌的最后一步是囊泡膜与胞浆膜融合的过程,当分泌发生时细胞膜的表面积会增加, 而细胞膜的电容大小正比于细胞膜的表面积(～1 μF/cm2),因此细胞膜电容的增加就代表细胞分泌量。这种技术对囊泡分泌的时间分辨率极高(～ms),常用来研究分泌事件与离子通道活动以及细胞内第二信使的关系。最近出现的细胞贴附膜片电容技术, 膜电容分辨率可达到0.1 fF, 能检测到直径60 nm的小囊泡分泌［2］。这一方法为研究单个小囊泡的分泌活动如膜融合孔开闭动力学、膜融合事件的分子调控等提供了强有力的工具。由于胞吐后囊泡膜的回收会导致膜电容的减少, 因此膜电容检测技术也能提供囊泡胞饮过程的信息。

　　膜电容测量技术可用于神经细胞、 内分泌细胞、 免疫细胞等大多数细胞的分泌测量, 而且测量精度和时间分辨率都较高, 但该方法不能排除胞吞对胞吐检测的影响,并且对试验条件如封接电阻(Rm)、 串联电阻(Rs)的要求很高, 对于一些较复杂结构如神经轴突终末、 与周边细胞有电学偶联的细胞等则不能用该技术进行研究。

　　1.2 电化学测量

　　用电化学技术监测细胞分泌的原理是: 在电极尖端表面施加一定的电压, 容易氧化的化学信使物质就会在电极尖端释放出电子而发生氧化,电极可获得电子并产生一定的电流［3］。微电极的电流大小与电极尖端面积和实验类型有关, 一般在pA到nA范围,通常采用膜片钳放大器等低噪声仪器进行检测。对单个分泌电流峰积分即可估算出每个囊泡中包含的递质分子数, 即量子包装的大小。施加的电压可为恒电位或三角波循环电压,前者的优点是时间分辨率高, 后者的优点是能区分不同的信息分子。在单细胞胞吐测量时两种方法可以互相补充。目前儿茶酚胺、 5-HT、 胰岛素、 组胺、 nO以及含色氨酸或酪氨酸残基的多肽激素或递质都可直接或间接地使用该方法检测［16］。

　　电化学技术监测分泌的最大优点是时间分辨率高(ms级), 能监测单个囊泡的释放以及囊泡中的递质含量, 且较膜电容测量更为直观; 其次具有一定的细胞空间分辨率,可用于测定细胞释放热区(hot spot); 另外, 该方法对细胞无损伤, 可进行长时间监测。但是电极只能检测到少部分信息物质(10％左右),而且对于那些不能被氧化的物质的释放不能直接检测［16］。本方法常与膜电容方法联合应用来研究分泌事件, 以相互补充。

　　1.3 细胞分泌的光学测量

　　用普通光学显微镜只能检测巨大囊泡的分泌过程,而新的荧光染料的开发和显微成像技术的发展使实时监测小囊泡的分泌成为可能［4］。FM1-43和FM4-64等是有效的研究分泌活动的选择性膜表面荧光标记物,它们在水相中没有荧光, 当它们插入脂质膜后则显示较强的荧光, 囊泡膜胞吐后会使细胞表面荧光增加, 而胞吞回收的囊泡因吞进细胞周围的染料而被荧光标记,这样便能够实时观察细胞的胞吐及胞吞过程。本方法的缺点是背景荧光较大, fM染料目前尚不能用于脑片等组织切片的分泌研究。另一种方法是通过基因转染方法将荧光基因如绿色荧光蛋白(GFP)基因转入靶细胞中并选择性地在囊泡中表达,然后用激光扫描共聚焦荧光显微镜等检测囊泡的运动过程［5］。例如, 将GFP基因与囊泡特异的前胰岛素基因整合后转入胰岛INS-1 β-细胞中进行表达,然后用荧光成像技术实时研究活分泌囊泡的转移、 锚定和胞吐过程。此外还有免疫荧光标记法: 多巴胺β羟化酶(DBH)在嗜铬细胞分泌囊泡中是一种主要的膜蛋白,由于它在胞吐中会出现在细胞膜的表面, 随着它与胞外液中荧光标记的DBH抗体的结合, 就能观察到胞吐位点在细胞膜上的分布以及囊泡膜的回收过程。1.4胞内信号分子光解方法

　　细胞分泌活动受很多因素的调控, 采用信使物质瞬时释放的方法［6］,可以定量研究各因素对分泌的影响。神经递质的分泌与细胞钙离子浓度紧密偶联(与钙离子浓度的3～4次方成正相关)。Ca2＋螯合物DM-nitrophen和Nitrophenyl eGTA可用于快速而均匀地提升细胞内钙离子浓度, 将这些物质与Ca2+染料通过膜片钳电极或孵育的方法导入细胞内, 然后经高能量的紫外光激发,便能产生一个迅速的、阶跃性的钙升高,并且整个细胞钙浓度都会均一地升高。这克服了单纯电刺激引起的离子通道附近产生不同的钙微区的缺点。DM-nitrophen在光解前对Ca2+有很高的亲和力,对静息的细胞钙缓冲几乎没有影响, 是研究细胞钙缓冲和钙稳态系统的非常理想的材料。通过控制激发紫外光的强度, 可以用来进行细胞内钙离子浓度滴定,也可用于钙结合力测定以及其他许多钙依赖的细胞功能活动。但是它易受Mg2+结合的影响。而Nitrophenyl EGTA对Ca2+有更高的选择性,但它在光解前对Ca2+亲和力较低, 且不易被光解产生大的Ca2+阶跃。除了Ca2+外, 许多第二信使如cAMP等都可用该方法对其细胞内浓度进行精确控制。

　　2 免疫细胞分泌的细胞和分子机制

　　2.1 免疫细胞的离子通道和细胞功能

　　免疫细胞不属于可兴奋性细胞(如神经细胞、 肌肉细胞等)之列, 但也具有某些与神经细胞相类似的电生理特性。离子通道的活动与离子跨膜流动、膜电位的变化以及随后的淋巴细胞激活密切相关。在大多数淋巴细胞上存在有不同的离子通道, 这些离子通道类似于神经细胞以及肌肉细胞的离子通道,但又有其自身的特点。Na通道仅存在于少数T细胞、 T细胞株和自然杀伤细胞。电压依赖性K通道存在于大多数T淋巴细胞、 T淋巴细胞株和巨噬细胞［7］,类似于神经细胞上的延迟整流K通道特性。 根据其电压激活和灭活的动力学特性以及药理学特征可分为3种亚型, 它们随细胞的发育状态和功能分类不同而有所变化,可能与细胞有丝分裂有关。丝裂酶原刺激后24 h可使K电流增大; K通道阻断剂则能剂量依赖性地抑制有丝分裂和抗原引发的淋巴细胞的激活,可能是“K通道开放-细胞膜去极化-Ca2+通道开放”通路被抑制后细胞外Ca2+内流减少所致［8］。Ca2+激活的K通道K(Ca)则由丝裂酶原引起的细胞Ca2+浓度升高激活,进而引发K外流和细胞膜的超极化。电压依赖性Ca通道仅在B淋巴细胞上存在, 而在T淋巴细胞以及T淋巴细胞株均未见报道;但T淋巴细胞上存在一种非电压依赖性的Ca2+通道, 由T细胞抗原所激活, 然后通过第二信使IP3, 引发细胞内Ca2+库释放,增强Ca2+离子跨膜内流或Ca2+依赖性灭活。

　　目前, Ca2+作为细胞内较早激活的一个重要的第二信使已被接受, 但其后续信号过程尚不清楚。T细胞的Ca2+信号可分成两相:快速的Ca2+峰和随后的Ca2+平台, 前者由细胞内钙库的释放引起, 后者则由CRAC引发的持续跨膜Ca2+内流引起。单细胞上的钙信号可表现为反复的钙振荡,这可能是一种通过频率编码来传递信息的方式。钙信号的频率特性可通过几种非线性反馈系统来调控, 如PKC介导的CD3γ亚基的磷酸化负反馈(可反馈抑制TCR/CD3的功能)、 ca2+信号放大正反馈(内质网Ca2+的释放和同时发生的CRAC以及PLC的进一步激活)、 ca2+离子的自身负反馈。关于G蛋白是否介导“TCR/CD3-PI水解-Ca2+动员”信号通路, 尚是一个悬而未决的问题,一些间接证据表明T细胞的激活需要G蛋白的参与, TCR/CD3可能在结构上形成G蛋白偶联受体［9］。联合应用膜片钳技术、单细胞荧光测量以及报告基因(如GFP、 rFP)等研究方法, 有望阐明免疫细胞的信号转导、 淋巴因子的分泌机制和其他相关的细胞功能。

　　2.2 免疫细胞分泌抗体或细胞因子的研究

　　经过适当处理, 免疫细胞可应用膜片钳测量细胞膜电容。膜电容正比于细胞膜表面积。当分泌小泡与细胞膜溶合并胞吐时, 便伴有膜电容的增加。人的中性粒白细胞是成功应用whole-cell和on-cell膜片钳法进行研究的少数免疫细胞之一［10］。通过膜片钳电极向细胞内导入GTPγS,可引起膜电容从静息时的3 pF增加到8～9 pF。有趣的是虽然GTPγS导入可引起暂时的Ca2+浓度升高和膜电容的增加,但当加入高浓度的Ca2+缓冲物质将钙升高阻断后, 膜电容的升高依然存在而不受Ca2+离子的影响, 表明GTPγS引起的分泌不需要Ca2+离子的参与,属于Ca2+非依赖性分泌, 这与经典的Ca2+依赖性分泌明显不同。进一步研究Ca2+和GTPγS的促分泌效率的差别和他们分别在什么情况下起作用将是一个重要课题。当向细胞导入高浓度Ca2+时,分泌过程呈现2种不同的动力学成分, 第一相只需要1～10 μmol/L的Ca2+, 而第二相则需要100～300 μmol/L的Ca2+浓度,他们分别对应免疫细胞内不同性质的囊泡, 即不同的Ca2+浓度控制不同的囊泡分泌, 以适应不同的细胞功能。

　　lollike等［2］应用细胞贴附式膜片钳技术在中性粒白细胞研究了免疫细胞脱颗粒的动力学, 包括单个囊泡融合的动力学特性, 用这种方法, 他们可以分辨出1 fF的阶梯状电容变化(对应单个囊泡分泌事件)。在形成封接后,他观察到一种自发的阶梯状膜电容降低, 代表直径60～165 nm的囊泡小泡的内吞。 当用Ionomycin刺激后, 可观察到0.1~5 fF大小不等的阶梯状电容升高,代表了白细胞不同类型囊泡的分泌(图2)。对于直径＞180 nm的囊泡可以直接观察到单个融合孔活动, 融合孔起始平均电导为150 pS, 最小的仅有35 pS,随后融合孔逐渐扩大, 扩展速度有快有慢, 与报道的巨大的囊泡融合孔特性类似。这是首次直接观察到直径＜500 nm的小囊泡的融合孔, 根据其起始电导小的特征,可以推测融合孔的形成必须有蛋白质参与。免疫细胞融合孔也存在闪烁开闭(flicker)的现象［11,12］, 这表明小囊泡的胞吐是可逆的。在融合孔闪烁过程中,其电导通常＜1 ns, 并且在开和关两种状态的大小是一致的, 这表明中性粒细胞的融合孔在低电导时不存在细胞膜脂质的流动; 这与肥大细胞上的研究结果不同,后者闪烁更快［13］, 融合孔打开值较关闭时的值小, 存在细胞膜脂质不断转移到囊泡的现象［14］。Lollike还发现一种假闪烁(pseudoflikers)现象:单个囊泡融合后会观察到一种渐进性的膜电容下降, 其原因尚不清楚, 可能是几个直径＜60 nm的小囊泡的快速融合的结果,也可能是电极内的小部分膜片逐渐贴到电极壁上所致。关于膜融合孔调控的分子机制研究还刚刚起步。马的嗜酸性白细胞含有巨大囊泡, 它的融合孔的扩大可由Ca2+和PKC通过不同的机制进行调节［15］;粒细胞的融合孔似乎在开放状态下也受到蛋白质的调控, 而中性粒细胞的融合孔的调控机制尚是空白。与融合孔的研究相比, 对膜分裂孔(fission pore)的研究非常有限, 因为胞饮囊泡通常非常小, 不能被全细胞膜电容记录所分辨, 而细胞贴附式膜电容记录可分辨出单个囊泡的胞饮, Lollike已经分辨出直径300～700 nm的小囊泡分裂孔［2］。该研究的进一步深入, 有望揭开囊泡融合晚期分子活动的神秘面纱, 这不但对细胞免疫学而且对神经科学和内分泌学都意义深远。

　　受whole-cell技术约束, 许多免疫细胞还不易用膜电容记录。但较新的微碳纤电极(CFE)技术可能弥补此缺。这种电化学方法灵敏度极高,可检测到单个小泡分泌［16］。

　　2.3 免疫细胞分泌功能的调控

　　免疫系统是生物体的防御系统, 免疫细胞抗体和细胞因子的分泌受到细胞内信号分子和细胞周围微环境的精确调控。 对肥大细胞的研究表明, PKC活性是调控肥大细胞脱颗粒的重要因素［17］。肥大细胞激活后,细胞内多个信号转导通路被激活, 导致炎症前细胞因子立即释放和其他细胞因子的延迟性释放。 这一过程除需要激活酪氨酸激酶(tyrosine kinase)外,还需要PKC的激活来使丝氨酸和苏氨酸磷酸化。对于PKCβ缺陷的小鼠, IL-6的分泌反应消失或减弱,而IL-3引发的肥大细胞增值反应和凋亡率不受影响。Cho等［18］用BLT酯酶分析(BLT esterase assay)在NK细胞的研究表明:细胞粘附分子ICAM-1能够抑制IL-12引发的NK细胞的脱颗粒和细胞毒性作用, 人ICAM-1抗体R6.5 mAb能阻断这一作用; fluo-3AM荧光测量的结果表明上述过程为Ca2＋依赖性分泌, ICAM-1能抑制NK细胞的Ca2＋离子内流。MHC-I类抗原NK细胞受体可抑制NK细胞的脱颗粒和自然杀伤作用,但是尚不清楚是哪种特异性受体介导了这种作用, 以及这些受体是否影响细胞因子分泌等NK细胞的其他功能。 最近的一项研究［19］表明, Ly-49A受体能调控NK细胞的囊泡胞吐和细胞因子的分泌,在NK细胞介导的细胞毒性作用过程中， 作为MHC-I分子的一个抑制性受体而存在, 而且仅通过由Ly-49A介导的信号转导过程就足以产生抑制效应。

　　90年代分泌机制的研究获得了突破性的进展, 发现细胞分泌的关键蛋白质复合体SNARE是导致包括神经元、内分泌细胞和免疫细胞在内的各种细胞分泌发生的共同分子机制［20］。

　　在可兴奋性的神经和内分泌细胞上, 分泌活动对Ca2+浓度呈3～4次方的依赖性,因此稍微提高膜融合分子与Ca2+的亲和力即有可能触发分泌。细胞可能通过不同种类囊泡的空间定位差异来实现特异的调控,也可能通过囊泡对钙离子的敏感性或其分泌动力学特性的不同来调控不同分泌活动。小囊泡由于其Ca2+阈值高和分泌速率快, 瞬间升高的Ca2+信号更能有效地触发其分泌;而大囊泡的分泌则更依赖于缓慢的幅值较低的Ca2+信号。区分不同囊泡动力学特性和Ca2+依赖性有助于了解不同分泌囊泡的分泌调控机制。当然细胞也可能通过不依赖Ca2+信号的其它信号系统来直接调控不同的分泌,例如PKC的激活可触发分泌［21］, g-蛋白偶联的受体latrophilin也可在无明显Ca2+信号升高的情况下触发分泌［22］。许多免疫细胞如T细胞、 B细胞、 肥大细胞、巨噬细胞等受到刺激后可以立即脱颗粒, 释放其炎症因子, 这一过程涉及的分子众多, 其分泌调控的复杂性不亚于神经细胞。

　　最近, Paumet等［23］在RBL-2H3肥大细胞株上对细胞胞吐的SNARE分子机制进行了研究, 发现了几种SNARE蛋白质复合体的异构体表达,其中一种23 kDa的SNAP (SNAP-23)对SNARE的形成非常重要。在syntaxin家族中, syntaxin4能够与SNAP-23以及其他的VAMP蛋白质分子, 但不能与破伤风毒素不敏感的VAMP(TI-VAMP)结合。Syntaxin 4的高表达能抑制FcepsilonRI依赖的的分泌活动,而syntaxin 2和syntaxin 3均无此作用。细胞内膜结构上存在4种VAMP蛋白: VAMP2、 cellubrevin、 tI-VAMP和VAMP8, 其中以VAMP8对细胞胞吐活动最为重要。这一研究首次表明,非神经元性的VAMP8异构体(最早在早期内体上发现)参与分泌囊泡的调控。

　　chen等［24］对血小板分泌的分子机制进行了研究, 揭示了SNAP-23在Ca2+引发的致密颗粒释放中的作用。血小板含有几种t-SNAREs, 如syntaxin2、 syntaxin 4、 syntaxin 7以及SNAP-23等, Ca2+引发的分泌可以被重组的α-SNAP加强而被抗NSF抗体所抑制; sNAP-23抗体或者抑制性C末端SNAP-23肽(inhibitory C-terminal SNAP-23 peptide)都可以致密颗粒的胞吐。在抗syntaxin抗体中,只有syntaxin 2抗体可以抑制致密囊泡的释放, 免疫沉淀印迹的结果证明在体内2个syntaxin 2和SNAP-23结合形成一个复合体。上述结果表明, sNAP、 NSF以及特异性t-SNARE都参与了致密囊泡脱颗粒过程。

　　3 免疫细胞的分泌活动和免疫-神经-内分泌网络

　　免疫系统、 神经系统以及内分泌系统之间的关系非常密切, 呈现一种复杂的相互影响的调节网络: 即“神经-免疫-内分泌网络”, 其中主要由激素、 神经递质、细胞因子三种物质来传递信息, 而这些信息分子的分泌是三者相互联系的一个基本环节。

　　免疫系统的稳定最终可归结为免疫因子分泌的平衡。免疫细胞的分泌活动除了受自身的调控外, 还受神经和内分泌系统的调节。形态学研究表明,在几乎所有免疫细胞上都有不同神经递质和激素的受体, 同时许多种神经递质和激素受体在免疫细胞上都有分布。功能研究表明, 很多激素和神经递质具有免疫调节功能。例如,肾上腺皮质激素就是最早发现的具有免疫调节功能的一种激素, 它对淋巴细胞、 巨噬细胞、 肥大细胞、 中性粒细胞都有抑制作用。而生长激素(GH)对几乎所有免疫细胞如淋巴细胞、巨噬细胞、 NK细胞、 胸腺细胞等都有促进分化和加强功能的作用。另一方面,免疫系统可以影响神经和内分泌系统。免疫细胞可以分泌多种细胞因子如淋巴因子和单核因子等, 而在神经和内分泌细胞上有相应的受体接收免疫系统的信息。

　　细胞因子和神经递质以及激素的多功能位点特性是其神经和免疫调节的分子基础。基因点突变的研究表明: IL-2分子具有相互独立的免疫功能位点和镇痛功能位点,而作为神经递质的内啡肽也有相互独立的镇痛和免疫调节结构域。除此之外, 许多细胞因子和递质都有多功能位点特征。另一方面, 细胞因子除了具有多功能位点特性外,还具有多受体介导机制, 即同一种细胞因子可作用于不同的受体而起到神经调节或免疫调节的作用, 如IL-2的中枢和外周镇痛作用可以被纳洛酮阻断,而其增值CTLL-2细胞的作用却不受影响。

　　细胞因子的分泌作为免疫系统信息调控的上游过程, 便成了“神经-免疫-内分泌网络”的一个基本而重要的环节, 免疫细胞活性物质的分泌不但受到免疫系统自身的精确调控,而且受到神经系统和内分泌系统的严格调节, 其中涉及的细胞和分子机制十分复杂, 相关的研究也处于探索阶段。

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